納米芯片快速檢測研究

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標準品及緩沖液

HDL、低密度脂蛋白（LDL）、VLDL標準品及納米金（5、10、20nm，CASno．7440575）、Tricine、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二醇、甲醇、甲基葡胺均購自美國Sigma公司。硝基苯并二唑C6酰基鞘氨醇（NBDC6ceramide）購自美國MolecularProbes公司。超速離心制備lLDL（密度為1．020～1．044kg／L）、sdLDL（密度為1．044～1．063kg／L）［6］。40mmol／LTricine緩沖液（pH值9．8），含40mmol／L甲基葡胺、0．02mmol／L十二烷基硫酸鈉、20nmol／L納米金（5nm）。所有試劑均為分析純，配制試劑用水為二次蒸餾水。

臨床資料

CHD患者35例，其中男20例、女15例，年齡56～78歲，均經(jīng)冠狀動脈造影證實有冠狀動脈病變。正常對照組30名，男15名，女15名，年齡33～70歲，均排除心腦血管疾病。四、血清樣本的采集及預(yù)處理2μL血清加入4μL緩沖液，再加入2μL0．1g／LNBDC6ceramide（乙二醇∶甲醇＝9∶1的混合液預(yù)先溶解）進行避光預(yù)染，1min后加入25μL緩沖液，此為電泳待測樣本。

芯片電泳過程

將4μL檢測樣本加入試樣池，5μL緩沖液分別加入試樣廢液池、緩沖液池、緩沖液廢液池，各電泳池插入電極。試樣池加＋750V電壓，試樣廢液池接地，緩沖液池加＋200V，緩沖液廢液池加＋300V，進樣40s后同時切換電壓進入分離階段。分離階段緩沖液廢液池加0V，緩沖液池加＋3100V，試樣池和試樣廢液池均施加＋300V，運行溫度25℃。分離電場強度為403V／cm。

納米金對脂蛋白分離的影響

芯片電泳分離混合的HDL標準品、VLDL標準品、lLDL和sdLDL，電泳圖譜見圖2。緩沖液中的納米金顆粒為5nm時，脂蛋白各組分完全分離，當(dāng)納米金顆粒＞5nm時，脂蛋白分辨率降低，分離效率下降。圖3為緩沖液中不同濃度的納米金對脂蛋白分離度的影響。當(dāng)納米金濃度為20nmol／L時，脂蛋白各組分之間實現(xiàn)基線分離。

芯片電泳與瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白的對比

芯片電泳與瓊脂糖凝膠電泳分離同一健康體檢者血清脂蛋白，結(jié)果見圖4。圖4（a）為脂蛋白瓊脂糖電泳圖譜，健康體檢者血清脂蛋白可分出3條區(qū)帶，分別為HDL、VLDL及LDL。圖4（b）為脂蛋白芯片電泳圖譜，電泳分離出4條特征峰，分別為lLDL、sdLDL、VLDL及HDL。相對于芯片電泳，瓊脂糖凝膠電泳分析時間長，分辨率不高，不能區(qū)分lLDL與sdLDL，而且LDL區(qū)帶容易拖尾。

線性范圍、檢測限和重現(xiàn)性

在優(yōu)化的分離條件下，lLDL、sdLDL、VLDL和HDL芯片電泳的線性范圍［信噪比（S／N）＝3］分別為0．01～0．8、0．04～1．0、0．04～1．0、0．02～0．8mg／L；檢出限分別為5、5、15和8μg／L。對健康體檢者的血清樣本連續(xù)測定5次，lLDL、sdLDL、VLDL和HDL的峰面積相對標準偏差（RSD）分別為3．5％、2．2％、4．5％、3．9％。

臨床樣本測定

對臨床確診的35例CHD患者和30名健康體檢者血清進行芯片電泳分析。CHD組與健康對照組比較，sdLDL與VLDL峰面積顯著增加（P＜0．01），HDL峰面積顯著下降（P＜0．001）。見圖5。

本文作者：汪驊1韓崇旭1王惠民2金慶輝3王大新1曹麗1董蘭梅1作者單位：1蘇北人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢測中心2南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心3中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所